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禽霍亂（Apm）核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）
2025-01版
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：禽霍亂（Apm）核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
禽霍亂是一種侵害家禽和野禽的接觸性疾病，又名禽巴氏桿菌病、禽出血性敗血癥。該病自然潛伏期一般2～9d,常呈現(xiàn)敗血性癥狀，發(fā)病率和死亡率很高，但也常出現(xiàn)慢性或良性經(jīng)過。本試劑盒適用于檢測禽的喉氣管、心肌和肺等組織和呼吸道分泌物等樣本中禽霍亂，適用于禽霍亂感染的輔助診斷
【檢驗原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，設(shè)計1對禽霍亂特異性引物，結(jié)合1條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對禽霍亂的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
Apm酶液 | 25μL×1管 |
Apm反應(yīng)液 | 975μL×1管 |
Apm陽性質(zhì)控品 | 50μL×1管 |
陰性質(zhì)控品 | 50μL×1管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽，取喉氣管、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，置于1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
水泡皮樣品：稱取水泡皮 0.5g于研磨器中研磨，加入生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液100μl于1.5ml滅菌離心管中；op液或水泡液樣品，直接取100μl置于 1.5ml 滅菌離心管中。
組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5ml 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液100μl于1.5ml 滅菌離心管中。
1.2 DNA提取
為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，建議使用商品化的DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | Apm反應(yīng)液 | 酶液 |
用量（樣本數(shù)為N） | 19.5μL | 0.5μL |
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；
熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測禽霍亂，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
2 | 40 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴(kuò)增曲線。
6. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
? 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；
? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線或無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30；
以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。
8. 性能指標(biāo)
（1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。
（2）特異性：100%。
（3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%。
【注意事項】
? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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